Validacion de tecnicas para deteccion de sangre, sangre humana y grupo sanguineo ABO

Validacion de tecnicas para deteccion de sangre, sangre humana y grupo sanguineo ABO

INTRODUCCIÓN:El hallazgo de sangre en manchas obtenidas en las escenas de las investigacionesforenses juega un papel fundamental en la resolución de los casos criminales. Además de laidentificación de sangre proveniente de un ser humano se puede tipificar el grupo sanguíneoal que pertenece y posteriormente realizar análisis de ADN [1].

Entre las técnicas más utiliza-das están las de Luminol, Fenolftaleína y Piramidón, como indicadoras de la existencia de san-gre, Takayama para confirmar su presencia, Inhibición de la Aglutinación para comprobar si lasangre es humana y Absorción-Elución para determinar el grupo ABO de la muestra [2].Aunque son ampliamente utilizadas es importante establecer su sensibilidad y efectividadcuando las muestras han sido sometidas a diferentes condiciones ambientales en diferentessoportes en vista que la mayoría de casos en criminalística presentan evidencias biológicas dediversos orígenes [3].Con el fin de evaluar estas técnicas y determinar la capacidad de los procedimientos paraalcanzar un resultado confiable se sometieron muestras conocidas a diferentes condiciones detemperatura, clase de soporte, dilución, ambiente y tiempo de exposición.MATERIAL Y MÉTODO:1.

Muestras, soportes y condiciones.
Se procedió a realizar manchas patrón con unamuestra conocida para evaluar la efectividad de los procedimientos frente a diferentes soportes,temperaturas, tiempo, contaminantes y diluciones para analizar la sensibilidad de la técnica. Se tomó muestra de sangre por punción venosa en tubo con anticoagulante EDTA y posteriormente seprocedió a realizar manchas sobre Algodón, Tela de Algodón, Seda, Lino, Satín, Jean delgado y Jeangrueso. Se expuso a una temperatura de -20°, 4°, 37° y 60° C por periodos de tiempo de 24 horas,una semana y un mes.2. Test de Piramidón, Fenolftaleina, Luminol.Pretratamiento de las muestras. En tubos de ensayo de 16 x 100 mm marcados con elnúmero de radicación del laboratorio y número de muestra se colocó un fragmento de la manchade 0,5 x 0,5 cm y se agregó 1 ml de solución salina al 0.85%, dejando por el tiempo que seanecesario para separar la mancha del soporte.Test de Piramidón. A 3 gotas de la muestra pretratada se le adicionaron 3 gotas de losreactivos de Piramidón, ácido acético y perhidrol evidenciando la reacción por un cambio decolor. (+) = coloración violeta, (-) = sin cambio de color [2].Test de Fenolftaleína y Luminol. Estas técnicas se realizaron con el método descrito porCox, M en 1991 [3] para Fenolftaleína y Castello, A et al. en 2002 [4] para Luminol.Interferencia de sustancias similares a la sangre. Con el fin de evaluar la interferencia desustancias que puedan generar resultados falsos positivos en la técnica de Piramidón se hicieronmanchas sobre tela de algodón de la siguientes Frutas: Banano, Cereza, Ciruela, Durazno, Fresa,Limón, Mandarina, Manzana, Melón, Mora, Naranja, Pera, Piña y Uva roja; Verduras: Cebolla,Rábano, Papa, Espinaca, Uva verde, Aguacate, Fríjol rojo, Repollo, Zanahoria, Coliflor, Maíz, Apio,Pepino Cocohombro, Berenjena, Ajo, Lechuga, Tomate, Remolacha y Pimentón; Otras sustancias:Vino tinto, Salsa de tomate, Café, Gelatina, Bebida carbonatada y Óxido; Fluidos biológicos comosaliva y orina.MR. Villegas et al.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005268

Validación de técnicas para detección de sangre, sangre humana y grupo sanguíneo ABO en diferentes soportes y condiciones con fines forenses.Manchas lavadas. Simultáneamente se tomó una muestra de sangre por punción venosaen tubo con anticoagulante de citrato de sodio y se realizaron cuatro manchas sobre tela de algo-dón las cuales fueron sometidas a un lavado con agua únicamente, con agua y jabón, agua y blan-queador y a la última se le adiciono aceite de cocina.Sensibilidad de las pruebas. Se tomaron muestras de sangre por punción venosa en tubocon anticoagulante EDTA, a cuatro personas con hemoclasificación A, B, AB y O, a las que se leshizo diluciones seriadas base 10, a partir de una dilución 1/10, así: 1/100, 1/500, 1/1.000, 1/ 5.000,1/10.000. De estas se hicieron manchas sobre algodón para la prueba de Piramidón.

Ya obtenidaslas diluciones de cada grupo sanguíneo se hicieron manchas por triplicado sobre diferentes sopor-tes como: Algodón, Tela de algodón y Papel Filtro. Para las pruebas de Piramidón, Fenolftaleina yLuminol. Para la prueba de detección de sangre por quimioluminiscencia (Luminol) se adicionaronotras diluciones además de las ya mencionadas: 1/100.000, 1/500.000, 1/1.000.000.3. Test de Takayama.Muestras, soportes y condiciones. Se tomó muestra de sangre por punción venosa entubo con anticoagulante EDTA y posteriormente se procedió a realizar manchas sobre Algodón, Telade Algodón, Seda, Lino, Satín, Jean delgado y Jean grueso. Se expuso a una temperatura de -20°,4°, 37° y 60° C por periodos de tiempo de 24 horas, una semana y un mes. A las manchas de 24horas se sometieron a ambientes cerrados, abiertos y en un recipiente con tierra negra.Sensibilidad de la prueba. Se tomaron muestras de sangre por punción venosa en tubocon anticoagulante EDTA, a personas con hemoclasificación de los cuatro grupos sanguíneos del sis-tema ABO (A, B, AB, O), a las que se les hizo diluciones seriadas a partir de 1/10, así: 1/100, 1/500,1/1.000, 1/ 5.000, 1/10.000.Test de Takayama. Con una hoja de bisturí se hizo un raspado de la mancha con el fin deobtener pequeñas escamas, las cuales se colocaron entre lámina y laminilla. Luego se agregó porcapilaridad una gota del reactivo de Takayama dejando en reposo de 10 a 20 minutos. Se observóal microscopio con objetivo de 10X y 40X incluyendo controles positivos y negativos.4. Determinación de sangre humana en manchas. Inhibición de la aglutinación.Muestras, soportes y condiciones. Las mismas del método de Takayama.Sensibilidad de la prueba. Igual que en el test de Piramidón.Prueba de Inhibición de la aglutinación. Se tituló el suero de Coombs y se seleccionaronlas 2 diluciones que demostraron mejor lectura. La muestra pretratada (Ver test de Piramidón) sepuso en contacto con las diluciones escogidas y glóbulos rojos sensibilizados al 2%. Se realizaroncontroles con sangre humana, sangre animal y solución salina al 0.85%.5. Absorción - Elución.Muestras, soportes y condiciones. Igual al test de Piramidón.Método de absorción-elución. Esta prueba se llevó acabo siguiendo el descrito por Nishi,K en 1985 [5].RESULTADOS:Los resultados se muestran en las tablas 1 a 9.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005269

MR. Villegas et al.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005270Tabla 1. Resultado de la prueba de Piramidón. + = Test positivo, la mancha puede corresponder a sangre, - = Testnegativo, +* = El test fue positivo pero con reacción retardada, N.P.= No Procesado. Área cerrada, abierta o enterra-do se refiere a que la muestra fue dejada en esa condición durante 24 horas antes de ser procesada.Tabla 2. Análisis de muestras con los test de Piramidón, Luminol y Fenolftaleina sometidas a diferentes procedimien-tos de limpieza. N.P = No se procesó.Tabla 3. Sensibilidad de los test de Piramidón, Fenolftaleina y Luminol en diferentes soportes. + = Test positivo,- = Test negativo y N.P. = No se procesó.

Validación de técnicas para detección de sangre, sangre humana y grupo sanguíneo ABO en diferentes soportes y condiciones con fines forenses.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005271Tabla 4. Resultado del Test de Takayama. + = Test positivo, la mancha corresponde a sangre, - = Test negativo,N.P.= No Procesado.Tabla 5. Tabla 5. Sensibilidad del test de Takayama en diferentes soportes. + = Test positivo, - = Test negativo yN.P. = No se procesó.

MR. Villegas et al.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005272Tabla 6. Resultado de la Inhibición de la aglutinación para determinar sangre humana en manchas. -/-: Indica quecorresponde a sangre humana. +/+ Indica que no corresponde a sangre humana.Tabla 7. Sensibilidad de la técnica de Inhibición de la aglutinación. -/-: Indica sangre humana, +/-: Dudoso, +/+: Nocorresponde a sangre humana.Tabla 8. Absorción-elución para determinacióndel grupo sanguíneo ABO. La mancha utilizadapertenecía en todos los casos al grupo O.O = Concuerda con el resultado esperado,INC = Inconcluyente.

Validación de técnicas para detección de sangre, sangre humana y grupo sanguíneo ABO en diferentes soportes y condiciones con fines forenses.

DISCUSIÓN:El test de Piramidón demostró ser una excelente prueba presuntiva en diferentes soportesy condiciones. Los resultados indican que hay que ser cuidadoso en su interpretación cuando lasmuestras han sido enterradas. No se observaron resultados falsos positivos al analizar sustancias conapariencia similar a la sangre. Para manchas que han sido sometidas a lavado con agua o detergentesel Luminol se muestra superior en su detección al Piramidón.Cuando se compara la sensibilidad de los 3 test presuntivos se observa que el más sensi-ble es el Luminol (Hasta 1/500.000) seguido de Fenolftaleina (Hasta 1/5.000). Estos resultados sonsimilares a los descritos por Cox, M. en 1991 para Fenolftaleína.El test de Takayama se ve afectado cuando la muestra ha sido expuesta a temperaturas altassin importar el tiempo de exposición.

La inhibición de la aglutinación se vio alterada cuando lasmuestras fueron enterradas y su soporte era Seda o Satín. La sensibilidad de las dos pruebas ante-riores es muy baja, detectando presencia de sangre y sangre humana en muestras diluidas hasta1/100. Se confirma que se requiere abundante cantidad de muestra para obtener un resultadoconfiable.La técnica de Absorción-elución para determinar el grupo sanguíneo se vio afectada princi-palmente por el soporte de tela Jean delgada o gruesa. La temperatura de almacenamiento elevada(60°C) solo alteró el algodón luego de un mes de recogida la muestra. Katsuji, N. et al. reportó quelos antígenos son termoestables inclusive cuando han sido purificados. El tiempo de almacenamientono afectó los resultados confirmándose lo referido por el mismo artículo. La sensibilidad de estaprueba se ve afectada cuando las muestras son diluidas en concordancia con otros reportes dondese encuentran resultados discrepantes cuando se trabaja con muestras húmedas [12].CONCLUSIONES:Las pruebas presuntivas y confirmatorias son una herramienta útil en el estudio de manchasde sangre en casos de investigación judicial.El Luminol se constituye como la prueba más apropiada en el estudio de posibles manchasde sangre sobre los test de Piramidón y Fenolftaleina.Las pruebas confirmatorias no se ven afectadas por las condiciones de exposición de lasmuestras o el soporte pero su sensibilidad es baja.AGRADECIMIENTOS:A la empresa VERITAS Química Forense por el suministro de los reactivos para los test deLuminol y Fenolftaleina. ❑Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005273Tabla 9. Sensibilidad de la técnica de Absorción-elución para determinación del grupo sanguíneo ABO.A, B, AB u O = Concordancia con el resultado esperado según cada grupo evaluado, INC = Inconcluyente.

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Por Mauricio

Fuente:
http://74.125.155.132/search?q=cache:8-eJRGg2nk4J:scielo.isciii.es/pdf/cmf/n42/original1.pdf+Validacion+de+tecnicas+para+deteccion+de+sangre,+sangre+humana+y+grupo+sanguineo+ABO&cd=1&hl=es&ct=clnk&gl=mx