TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN Y SU APLICACIÓN EN LAS CIENCIAS FORENSES
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
INSTITUTO DE BIOLOGÍA
Medellín
2005
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
La evolución genómica tuvo su apogeo en el año 2000 y está basada en los aportes de cuatro investigadores; Maxam y Gilbert, quienes desarrollaron en los años 70 el método químico se secuenciación de DNA; luego Frederick Sanger, quien en 1977 perfeccionó el método enzimático de secuenciación; y por último Leroy Hood, quien junto con sus colegas, Michael Hunkapiller y Lloyd Smith, en 1986, modificaron el método de Sanger
A finales de los años 70 se desarrollaron los métodos que permitieron de manera simple y rápida, determinar la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de ADN. Estos primeros intentos de secuenciar ácidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las moléculas en pequeños fragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este método resulta relativamente sencillo para proteínas donde estas resultan de la combinación de hasta 20 aminoácidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes
MÉTODO QUÍMICO DE SECUENCIACIÓN
Desarrollado por Maxam y Gilbert en 1977. Se basa en las propiedades químicas de las cuatro bases que componen el ADN que las hacen susceptibles a modificaciones específicas. Consiste de los siguientes pasos:
1. Fragmentación
Antes de comenzar se debe preparar el ADN genómico para que este pueda ser secuenciado. Esto consiste en fragmentar el ADN genómico, el método mas utilizado es mediante el corte enzimático utilizando enzimas de restricción, pero también puede emplearse cualquier otro método de fragmentación selectiva.
2. Marcaje del ADN.
Se puede realizar a partir de un ADN de cadena doble o sencilla, Este paso consiste en el marcaje de uno de los extremos de la cadena. Para marcar el extremo 5’ radiactivamente con 32ATP primero se debe quitar el fósforo presente en este extremo por medio de la hidrólisis utilizando la enzima fosfatasa alcalina y luego se adiciona el fosfato marcado transferido desde al ATP por medio de la enzima polinucleótido kinasa.
El extremo 3’ también puede ser marcado radiactivamente. Actualmente se han desarrollado fluorocromos para marcar ambos extremos y así facilitar la detección del marcaje.
3. Modificación de las Bases y fragmentación del ADN
Esta es la etapa más importante y fundamental de todo el procedimiento; en ella se busca generar fragmentos de ADN de cadena sencilla de tamaños variables, cuyo nucleótido final sea conocido. Así, el tamaño de la hebra final indicará el orden de la secuencia, de acuerdo con el último nucleótido.
La reacción debe ser llevada a cabo en cuatro tubos diferentes. En cada tubo se adicionan compuestos químicos que modifican las bases específicamente (Dimetil sulfato, Formato de piperidina, Hidracina y Hidracina + Alcali).
El Dimetil Sulfato, metila el N7 de las Guaninas, debilitando el enlace entre los C8 y C9 para que sean susceptibles a la ruptura. El Formato de piperidina debilita el enlace glicosidico de las Adeninas y Guaninas protonando átomos de nitrógeno en los anillos de purina, lo cual conduce eventualmente a la depurinizacion. La Hidracina rompe el anillo pirimidico, el cual al recircularizarse queda en forma de pentosa (solo 5 enlaces y no 6). En presencia de álcali y NaCl la hidracina solo actúa sobre las Citosinas. El álcali en presencia de NaOH hace una ruptura selectiva de A>C. (Molecular cloning)
Luego para remover las bases modificadas se adiciona Piperidina, la cual en solución acuosa y a 90 ºC remueve las bases modificadas rompiendo el enlace azúcar-fosfato. (Molecular cloning)
Para fragmentar las cadenas se adiciona piperidina, la cual corta el ADN en el azúcar al cual le falta la base. (Molecular cloning)
Las reacciones químicas deben realizarse con un estricto control de tiempo, temperatura y concentraciones tanto de los compuestos químicos como de las moléculas de ADN. (Molecular cloning)
4. Separación de los fragmentos y análisis
Esta es la etapa final del procedimiento y consiste en establecer la secuencia de la cadena de ADN, utilizando la electroforesis en geles de poliacrilamida de alta resolución y una posterior detección autoradiográfica. La secuencia final es resuelta por la migración de los fragmentos de ADN, según su tamaño, dependiendo de la base sobre la cual se haya generado el corte químico.
La lectura del gel se realiza de abajo hacia arriba, siendo el extremo inferior el correspondiente al extremo 5’.
Ver Anexo 1
MÉTODO ENZIMÁTICO DE SECUENCIACIÓN
El método predominante hoy en día para la secuenciación del ADN es la técnica enzimática, conocida como el secuenciamiento didesoxi o el método de Sanger. Se basa en la interrupción controlada de la síntesis in vitro de una hebra complementaria al ADN de interés.
Este método se basa en que la síntesis in vitro de ADN catalizada por la enzima DNA pol puede ser interrumpida controladamente por la adición al azar de un didesoxinucleótido (ddNTP). Los didesoxinucleótidos son deoxinucleótidos que les falta un grupo hidroxilo en las posiciones 2' y 3' y por eso no se pueden unir a otros nucleótidos, por lo tanto no se puede continuar con la extensión de la cadena. Es decir, actúan como terminadores de la cadena.
Síntesis de la cadena complementaria de ADN
Para realizar la reacción de síntesis in vitro de necesita:
Cadena de ADN molde: Se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.
Primer para iniciar la síntesis: Se necesita un corto oligonucleótido complementario al extremo 3’ de la cadena.
DNA polimerasa (Fragmento Klenow)
Desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP.
Didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación (pe. ddATP)
Preparación para la reacción de secuenciación
Típicamente, en un secuenciamiento manual, se realizan cuatro reacciones, una para cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos terminadores de la cadena. En adición, ya sea el primer, usado para empezar la reacción, o uno de los desoxinucleótidos normales, está marcado; esto puede ser mediante un átomo radioactivo. El didesoxinucleótido está presente en una concentración aproximada de 200 veces menor que su nucleótido competitivo. Por lo tanto, se presenta una competencia entre deoxinucleótidos y dideoxinucleótidos (pe. dA y ddA) para incorporarse en la cadena creciente.
Separación de los fragmentos
Para separar los fragmentos de longitud variable producidos en cada tubo, las muestras de cada tubo son separadas en cuatro pozos en una electroforesis de poliacrilamida desnaturalizante.
Detección del marcaje
A los geles de poliacrilamida se les toma una autoradiografía y se hace la lectura de las bases de abajo hacia arriba. Se debe tener en cuenta que la secuencia obtenida es la del ADN complementario al ADN de interés y por lo tanto se debe hacer la conversión.
Ver Anexo 2
AUTOMATIZACIÓN DE LA SECUENCIA
Es una alternativa al método de Sanger. Consiste en marcar el primer o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reacción de secuencia. Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforésis al pasar por delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida. Actualmente, existen dos formas de realizarlo:
Secuenciación empleando primers fluorescentes
Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el oligonucleótido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un único tubo. Las sondas fluorescentes utilizadas son:
para A ---> JOE. Emisión: verde. Derivado de fluoresceína
para C ---> FAM. Emisión: azul. Derivado de fluoresceína
para G --> TAMRA. Emisión: amarillo. Derivado de rodamina
para T --> ROX. Emisión: rojo. Derivado de rodamina
Durante la electroforesis las bandas del ADN de cadena sencilla pasan a través de un láser de argón que excita las sondas fluorescentes, la señal de emisión de fluorescencia, una vez amplificada, es detectada a través de un filtro y asignada a la base correspondiente.
Secuenciación empleando terminadores fluorescentes
Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.
Éste método es el más utilizando actualmente.
SECUENCIADORES AUTOMATICOS
Secuenciación automática en geles desnaturalizantes de poliacrilamida
La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de poliacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre un cassette que sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplará en el secuenciador automático para proceder a la carga de la muestras. El secuenciador utilizado en este tipo de secuenciación es un ABI PRISM 377
El secuenciador automático ABI Prism 377 es un sistema de electroforesis y detección de fluorescencia controlado por microprocesador que se utiliza para secuenciación automática o análisis de fragmentos empleando el método de secuenciación automática en geles desnaturalizantes.
Durante la electroforesis las muestras pasan por delante de un haz de luz UV procedente de un láser de argón. La fluorescencia emitida por cada fragmento de ADN, correspondiente a la emisión de fluorescencia del nucleótido incorporado en 3´ (para secuenciación automática empleando terminadores fluorescentes), es recogida por una cámara CCD, encargándose el software del equipo de asignar a la fluorescencia emitida la base correspondiente
Secuenciadores automáticos capilares
Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al sistema basado en geles de poliacrilamida donde este soporte ha sido sustituido por un polímero que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la muestra de secuenciación; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza para lecturas no superiores a unos 450pb. El secuenciador utilizado en este tipo de secuenciación es un ABI PRISM 310
El ABI Prism 310 es un instrumento automatizado que analiza fragmentos de ADN con marcas fluorescentes usando la electroforesis capilar. Los tubos con las reacciones de secuenciación son puestos en una gradilla para 48 o 96 muestras. El ingreso al capilar de las muestras se realiza por inyección electrocinética, esto es un corto período de electroforesis donde el capilar y el cátodo se encuentran inmersos en la muestra. Posteriormente el extremo del capilar cercano al cátodo se sumerge en tampón y se aplica corriente para continuar la electroforesis.
Cuando los fragmentos de DNA alcanzan la ventana del capilar, el láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia emitida por los colorantes es colectada por el detector a longitudes de onda particulares y registrada como señales digitales en el computador. Para el procesamiento de los datos se utiliza el software "Sequencing Analysis" que asigna las bases para cada intensidad de fluorescencia detectada.
OTROS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
Microarreglos
Pirosecuenciación
APLICACIÓN EN LAS CIENCIAS FORENSES
Por mas de 15 años, los métodos analíticos de tipificación de ADN han sido utilizados en todo el mundo para resolver asuntos de individualización en diferentes delitos como, homicidios, delitos sexuales, actos de terrorismo, casos de personas extraviadas y desastres masivos. Estos métodos incluyen la tipificación de loci polimórficos en la longitud de los fragmentos de restricción de número variable de repeticiones en tandem (VNTR), los sistemas para el análisis de los polimorfismos de un sólo nucleótido (SNP) basados en la PCR, loci de las repeticiones cortas en tandem (STR) y el secuenciamiento directo del ADN, entre otros. (Budowle et al., 2003)
El análisis de la secuencia del ADN es utilizado en las ciencias forenses a partir de diversos tipos de muestras (hueso, diente, sangre, manchas de sangre, colillas de cigarrillos, pelos, saliva, semen, músculo, etc.) (Melton y Nelson, 2001), con las cuales se ha logrado establecer diversas aplicaciones como la identificación de restos esqueléticos (Stoneking et al., 1991; Holland et al., 1993; Rousselet y Mangin, 1998); la obtención de perfiles genéticos a partir de huellas dactilares (Balogh et al., 2003); la solución de casos en criminalística, pruebas de filiación, entre otros.
El poder discriminatorio de la técnica reside en las características polimórficas que contiene toda la secuencia del ADN analizado. La secuencia de ADN obtenida puede ser comparada con muestras de referencia a partir de bases de datos poblacionales para estudios evolutivos o antropológicos o a partir de muestras de casos forenses para la individualización. (Galván y Hurtado, 2001)
El perfil de ADN nuclear es altamente informativo y los métodos para analizarlo están plenamente desarrollados y disponibles, pero debido a la naturaleza de las circunstancias en que ocurren los casos de interés forense, en algunas ocasiones es preferible realizar la secuencia del ADN mitocondrial sobre el ADN nuclear ya que proporciona información útil que puede ser utilizada para establecer la identidad de una muestra biológica especialmente cuando el DNA está degradado, o se tiene poca cantidad muestra. (Isenberg, 2002)
BIBLIOGRAFÍA
Budowle B, Allard WM, Wilson RM, Chkraborty R. 2003. Forensic and Mitochondrial DNA: Applications, Debates and Foundations. Annual Review Genomics of Human Genetics 4: 119-141
Melton T, Nelson K. 2001. Forensic Mitochondrial Analysis: Two years of Commercial Casework Experience in the United States. Croatian Medical Journal. 42(3):296-303
Stoneking M, Hedgecock D, Higuchi RG, Vigilant L, Erlich HA. 1991. Population variation of human mtDNA control region sequences detected by enzymatic amplification and sequence-specific oligonucleotide probes. American Journal of Human Genetics 48(2):370-382.
Rousselet F, Mangin P. 1998. Mitochondrial DNA polymorphisms: a study of 50 French Caucasian individuals and application to forensic casework. International Journal of Legal Medicine 111:392-298
Holland M, Fisher D, Mitchell L, Rodriguez W, Canik J, Merreil C, Weedn V. 1993. Mitochondrial DNA sequence analysis of human skeletal remains: Identification of remains from Vietnam war. Journal of Forensic Science. 39(3):542-553)
Isenberg AR. 2002. Forensic Mitochondrial DNA Analysis: A Different Crime Solving Tool. FBI Law Enforcement bulletin. 71(8) version digital.
Balogh MK, Burger J, Bender K, Schneider PM, Alt KW. 2003. STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper. Forensic Science International. Article in press
Galvan AL, Hutado MV. 2001. Organización, polimorfismos y evolución del ADN mitocondrial: descripción de los métodos de extracción, protocolos de PCR y su aplicación en la práctica forense. Monografía de especialización. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
MUESTRA PAGINA WEB
Lometí MG, Tamayo R. 2005. Deterioro Ambiental. Universidad Autónoma de Mexico. Homepage . Fecha de consulta: 10 de marzo de 2005.
La locura: http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htm
Maxam http://bio.kaist.ac.kr/~mbtlab/Lecture08.htm#GENE%20SEQUENCING
Dideoxi : http://www.juntadeandalucia.es/averroes/recursos_informaticos/concurso00/premio_3/vigdidesoxi.html
http://www.rvc.ac.uk/review/DNA_1/2_DNA_Sequencing.cfm
GENES
MOLECULAR CLONING
ANEXOS
MÉTODO QÚIMICO DE SECUENCACIACIÓN
MÉTODO ENZIMÁTICO DE SECUENCIACIÓN